De groeiende wereldwijde markt van biofarmaceutische producten en synthetische polypeptiden verloopt simultaan met het aanbod van illegale preparaten. Hierdoor is het van belang om over een methode te beschikken die illegale polypeptiden kan detecteren. De meest gebruikte vorm van chromatografie bij de analyse van illegale polypeptiden is Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS). Aangezien met deze techniek niet altijd een goede scheiding wordt bekomen, is er nood aan alternatieven. Daarom werd in deze masterthesis een Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography - Photodiode Array Detector (HILIC-PDA) methode ontwikkeld voor de detectie van illegale polypeptiden. In eerste instantie werd de aanwezigheid van het correcte actief pharmaceutisch ingrediënt (API) en mogelijke onzuiverheden onderzocht bij de niet-gecertificeerde polypeptiden via LC-MSn . Door het vergelijken van het MS precursor ion en de MS/MS fragment ionen met deze van een standaard, kon worden geconcludeerd dat elke vial wel degelijk het juiste API bevatte. Bij AOD9604 was dit API in een lage hoeveelheid aanwezig en de API-gerelateerde onzuiverheden in een relatief hoge hoeveelheid. Hierna vond de kolomstudie plaats waarbij de chromatografische parameters resolutie (RS) en symmetriefactor (AS) werden getest bij vijf kolommen met verschillende soorten stationaire fases (BEH Amide, BEH HILIC, CORTECS® , ZIC® -HILIC en ZIC® -cHILIC kolom). Dit gebeurde bij drie temperaturen (30°C, 40°C, 50°C) en vier elutiesnelheden (0,2 ml/min, 0,3 ml/min, 0,4 ml/min, 0,5 ml/min). Als mobiele fasen werden een 10 mM ammoniumformaat 80% acetonitrille (ACN) oplossing met pH 3 en een 10 mM ammoniumformaat 40% ACN oplossing met pH 3 aangewend. Aangezien humane insuline, runder- en varkensinsuline in een 80% ACN oplossing niet of weinig werden gedetecteerd, werden deze polypeptiden buiten beschouwing gelaten bij de methodeontwikkeling. Met behulp van respons oppervlakken en chromatogrammen werd voor elke kolom de meest optimale temperatuur en elutiesnelheid gekozen. Aan de hand van deze parameters werd de meest performante kolom gekozen. Dit resulteerde in de ZIC® -HILIC kolom bij elutiesnelheden van 0,2 ml/min en 0,3 ml/min. Hierna werd de scheiding nagegaan bij hogere temperaturen (55°C, 60°C, 65°C, 70°C) waarbij uiteindelijk een temperatuur van 50°C werd geprefereerd. Ook werd de selectiviteit onderzocht door het testen van polypeptiden in verschillende matrices. Door het vergelijken van de resolutie in de aan- en afwezigheid van de matrix bij de kritische peptidenparen AOD9604 - ipamoreline en GHRP-2 - leuproreline werd voor een elutiesnelheid van 0,2 ml/min geopteerd. Hierna werd de gradiënt aangepast voor de polypeptiden GHRP-2, leuproreline en melanotan II door de gradiënt 2, 5 en 10 minuten in de tijd te verlengen. Op deze manier werd een HILIC-PDA methode ontwikkeld die nog getest zal worden met behulp van massaspectrometrie.
