Adenovirus (AdV) typage, genotypage et phenotypage

But du test

Utilisation clinique
Détecter la résistance antivirale chez les patients atteints d’une infection à l’adénovirus (AdV).

Contexte clinique
Les adénovirus (AdV) sont des agents pathogènes humains omniprésents qui causent généralement des maladies auto-limitantes, bien qu’ils soient responsables de maladies graves chez les enfants et les individus immunodéprimés. Les symptômes et les manifestations cliniques dépendent en grande partie du type d’adénovirus, de l’état immunitaire de l’hôte et du site de l’infection. Il existe plus de 60 types d’adénovirus humains génétiquement distincts (divisés en espèces A-G), chaque type infectant préférentiellement certains tissus et provoquant un éventail de maladies distinctes.

Les receveurs de greffes de cellules souches hématopoïétiques et d’organes solides (HSCT et SOT), les personnes atteintes de déficiences immunitaires congénitales ou les patients atteints d’infections VIH non contrôlées peuvent souffrir de colite, d’hépatite, d’encéphalite ou de maladie disséminée et présenter un risque accru de mortalité en raison d’une infection à AdV. Chez les personnes immunodéprimées, la maladie à AdV peut être liée non seulement à une infection primaire, mais aussi à une réactivation d’une réserve latente de virus déjà présente chez l’individu ou dans la greffe. Après une infection primaire, AdV reste latent dans le système lympho-réticulaire et chez les patients immunodéprimés, la réactivation augmente les taux de morbidité et de mortalité.

Actuellement, il n’existe pas de thérapies antivirales spécifiques à AdV approuvées et les options thérapeutiques actuelles sont limitées. Elles incluent la suppression préemptive de la réplication d’AdV à l’aide d’antiviraux tels que le cidofovir et/ou de l’immunothérapie.

Critères pour réaliser ce test dans le cadre des activités de référence

Des études in vitro ont montré l’émergence de la résistance au cidofovir chez AdV. Par conséquent, la résistance aux médicaments d’AdV pourrait apparaître en clinique après un traitement prolongé avec ce médicament antivirale à large spectre contre les virus à ADN.

Détails du test – Typage/genotypage d’AdV

Comprend :

1. Typage des adénovirus, car des jeux de primers spécifiques doivent être utilisés pour amplifier l’ADN polymérase, qui est partiellement conservée entre les différents types d’AdV.
2. Résistance au cidofovir : mutations dans le gène de l’ADN polymérase E2B d’AdV.

Description du test – Typage/genotypage d’AdV

Typage des adénovirus

1. Isolement de l’ADN viral à partir de l’échantillon.
2. Amplification du gène hexon de l’adénovirus par PCR.
3. Séquençage direct du gène hexon.
4. Les séquences obtenues sont comparées à la base de données NCBI à l’aide du logiciel BLAST. Les séquences homologues fortement similaires des HAdVs précédemment publiées avec les scores les plus élevés sont considérées comme des résultats d’identification du type d’adénovirus humain.

Génotypage des adénovirus

1. Amplification du gène de l’ADN polymérase (E2B) par PCR

AdV gene	AdV encoded protein	Function / drug target	Codons sequenced (partial or complete gene sequence)	Drug(s) for which resistance is predicted
E2B	DNA polymerase	Target of cidofovir	Complete sequence	Cidofovir

2. Séquençage direct du gène de l’ADN polymérase par séquençage Sanger, avec une limite de détection des sous-populations mutants virales de 20%-30% des amplifications.

3. Alignement des séquences (les séquences dérivées de l’isolat du patient sont alignées contre la souche de référence d’adénovirus).

4. Les mutations détectées sont comparées à une base de données de mutations connues associées à la résistance aux médicaments ou à des polymorphismes naturels (variabilité entre souches) pour déterminer si la résistance clinique à l’infection par AdV est due à une résistance virale aux médicaments.

Interprétation des résultats – Typage/genotypage d’AdV

Les résultats comprennent une liste des mutations détectées et leur association avec la résistance à chaque médicament spécifié, la variabilité entre souches, ou leur signification imprévisible (changements nouveaux). En fonction du génotype viral, des options thérapeutiques alternatives sont suggérées.

Un résultat de typage ou de genotypage incomplet ou indisponible indique que tous les amplifications virales n’ont pas pu être amplifiées et séquencées. Cela peut être dû à une charge virale insuffisante, à la qualité de l’échantillon (conditions de stockage et de transport, âge de l’échantillon), et/ou à la présence d’inhibiteurs de la réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Limites des tests de génotypage pour la résistance aux médicaments d’AdV

Les résultats des tests ne détectent pas les mutations présentes dans 20-30% de la population virale.
Les tests sont plus fiables si la charge virale dans l’échantillon est d’au moins 3 log10 IU/ml (1 000 IU/ml). Les résultats pour les échantillons ayant des charges virales plus faibles doivent être interprétés avec prudence et doivent être confirmés dans un nouvel échantillon.
En raison de l’apparition possible d’artefacts génotypiques, en particulier dans les populations mixtes de mutants d’échantillons à faible charge virale, il est conseillé de refaire le test dans un nouvel échantillon.

Détails du test – Phénotypage d’AdV

1. Croissance de l’échantillon viral dans des fibroblastes pulmonaires humains embryonnaires (HEL) jusqu’à ce qu’un effet cytopathique (CPE) de 100% soit atteint.
2. Préparation du stock viral.
3. Essai antiviral effectué dans des cellules HEL en utilisant au moins deux inoculums viraux différents et des souches de référence d’AdV provenant de différents types.
4. Détermination de la EC50 (concentration efficace à 50%) ou de la concentration du médicament nécessaire pour inhiber le CPE viral de 50% pour chaque médicament antiviral.
5. Comparaison des valeurs EC₅₀ entre la souche de référence et l’échantillon du patient, et détermination de la résistance relative (rapport EC₅₀ de l’échantillon du patient/EC₅₀ de la souche de référence).

Interprétation des résultats phénotypiques d’AdV

Les résultats comprennent les valeurs EC₅₀ et la résistance relative pour différentes classes de médicaments anti-HSV, inhibiteurs de l’ADN polymérase, y compris des analogues de nucléotides (cidofovir), des analogues de pyrophosphate (foscarnet), ainsi que le ribavirine.

Limites des tests phénotypiques pour la résistance aux médicaments d’AdV

• Les tests phénotypiques ne peuvent pas être effectués pour des échantillons de liquide céphalo-rachidien, de fluide oculaire, de sang ou de prélèvements par écouvillon en raison de l’incapacité de cultiver le virus à partir de ces types d’échantillons.
• Pour une isolation virale réussie, l’échantillon doit être collecté immédiatement dans un milieu de transport viral, stocké réfrigéré à 2-8°C et transporté réfrigéré dans les 48 heures suivant la collecte de l’échantillon.

Instructions pour les échantillons et le transport

https://rega.kuleuven.be/regavir/shipping

Demandes inacceptables

• Échantillon inapproprié ou insuffisant.
• Transport ou stockage incorrect de l’échantillon.
• Formulaire de demande de test non entièrement rempli sans spécification du virus pour lequel la résistance aux médicaments doit être étudiée.

Délai de traitement (et fréquence de l’analyse)

Fréquence des analyses: chaque jour ouvrable, pendant les heures de travail.
Temps de réponse: 3-7 jours ouvrables (typage/genotypage).
                                10-20 jours ouvrables (phénotypage).

Rapport des résultats du test

Les résultats seront envoyés par e-mail selon les souhaits du laboratoire ou du médecin demandeur.