Génotypage et phénotypage de Varicella-zoster virus (VZV)

But du test

Utilisation clinique

Détecter la résistance antivirale chez les patients atteints d’infections par le virus varicelle-zona (VZV).

Contexte clinique 

Le virus varicelle-zona (VZV) est un herpèsvirus humain ubiquitaire, appartenant à la sous-famille des alpha-herpèsvirus, affectant les populations du monde entier. Le VZV est couramment acquis pendant l’enfance et provoque une infection primaire, la varicelle. Après l’infection initiale, le virus établit une latence à vie dans les ganglions sensoriels, avec un risque de réactivation subséquente entraînant le développement du zona (HZ), une éruption cutanée douloureuse également connue sous le nom de «shingles». L’incidence et la gravité du HZ sont plus élevées en cas d’immunité cellulaire spécifique altérée, principalement en raison du vieillissement, de la malignité, de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) ou de transplantation d’organes solides (SOT), de l’immunodéficience ou d’un traitement immunosuppresseur. En particulier, le HZ reste une cause importante de morbidité chez les patients subissant une transplantation cardiaque par rapport à d’autres receveurs de SOT (transplantation du foie, des reins ou des poumons). Ces patients présentent un risque accru d’infection primaire, de réactivation, de dissémination virale avec atteinte viscérale, de surinfection bactérienne et de récidives fréquentes. Les infections par le VZV peuvent également provoquer des névralgies débilitantes chez les patients immunodéprimés sévèrement.

Les médicaments actuellement autorisés pour prévenir ou traiter les maladies associées au VZV ciblent l’ADN polymérase virale. L’acyclovir et son pro-médicament le valacyclovir sont considérés comme le traitement de première ligne, tandis que l’utilisation du foscarnet ou du cidofovir est limitée au traitement des infections résistantes à l’acyclovir et/ou au foscarnet. Le mécanisme d’action et le mode de résistance des médicaments utilisés pour traiter les infections par le VZV sont similaires à ceux utilisés pour traiter les infections par le HSV. Les analogues de nucléosides sont d’abord phosphorylés par la thymidine kinase du VZV [cadre de lecture ouvert 36 (ORF36)], suivis d’une activation par des kinases cellulaires pour produire les formes actives triphosphates qui bloquent l’ADN polymérase virale (ORF28). L’inhibiteur de l’hélicase-primase amenamevir est approuvé uniquement au Japon pour le traitement du zona. En raison de son efficacité contre les isolats résistants à l’acyclovir du VZV et du HSV, amenamevir peut être utilisé comme une alternative viable pour les patients qui échouent au traitement de première ligne. Ce médicament n’est disponible que dans le cadre d’un usage compassionnel en tant que traitement alternatif en cas d’infections résistantes ou réfractaires au HSV ou au VZV.

Critères pour réaliser ce test dans le cadre des activités de référence

Les infections résistantes à l’acyclovir par le VZV ont été rapportées chez les patients immunodéprimés, mais pas chez les individus immunocompétents. Pour les patients présentant un échec thérapeutique dans les 7 à 10 jours suivant un traitement antiviral, la génotypage du VZV devrait être évaluée, et des médicaments alternatifs comme le foscarnet et le cidofovir, tous deux inhibiteurs de l’ADN polymérase agissant indépendamment de la thymidine kinase virale, sont recommandés.

Les infections par le VZV cliniquement réfractaires et/ou résistantes affectant l’œil ou le système nerveux central doivent être génotypées tant chez les patients immunocompétents que chez les patients immunodéprimés. Les échantillons oculaires et de liquide céphalo-rachidien (LCR) doivent être testés rapidement pour détecter les mutations, les délétions et/ou les substitutions dans des codons spécifiques du génome du VZV afin d’évaluer l’émergence de résistance à l’acyclovir et d’ajuster la thérapie antivirale en fonction du génotypage du VZV.

Le test de résistance au VZV repose principalement sur l’analyse de séquence des gènes de la thymidine kinase virale (ORF36) et de l’ADN polymérase (ORF28), car la culture du virus est rarement réussie étant donné que le virus libre est assez instable. Étant donné que la compartimentalisation des mutants viraux du VZV se produit fréquemment, les échantillons provenant de différents sites corporels (comme diverses lésions cutanées, LCR, lavage broncho-alvéolaire, œil) doivent être étudiés longitudinalement pour détecter l’émergence de la résistance aux médicaments et évaluer la dynamique virale.

Détails du test – Génotypage du VZV

Inclut:

1. Résistance à l’acyclovir : mutations dans les gènes ORF36 de la thymidine kinase et ORF28 de l’ADN polymérase du VZV.
2. Résistance au cidofovir : mutations dans les gènes ORF28 de l’ADN polymérase du VZV.
3. Résistance au foscarnet : mutations dans les gènes ORF28 de l’ADN polymérase du VZV.

Description du test – Génotypage du VZV

1. Isolation de l’ADN de l’échantillon.

2. Amplification des gènes du VZV impliqués dans la résistance aux médicaments par PCR en fonction du traitement administré au patient.

VZV gene	VZV encoded protein	Function / drug target	Codons sequenced (partial or complete gene sequence)	Drug(s) for which resistance is predicted
ORF36	Thymidine kinase	Involved in activation of acyclovir, penciclovir, ganciclovir, and brivudin	341 (complete sequence)	(Val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin
ORF28	DNA polymerase	Target of acyclovir, penciclovir, ganciclovir,  brivudin, foscarnet, cidofovir	425-1000 (partial sequence)	(val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin, foscarnet, cidofovir

3. Séquencement direct des amplicons par séquencement Sanger dideoxy, avec une limite de détection des sous-populations mutantes virales de 20%-30%.

4. Alignement des séquences (les séquences dérivées de l’échantillon du patient sont alignées avec les séquences de la souche de référence VZV OKA).

5. Les mutations détectées sont comparées à une base de données de mutations connues associées à la résistance aux médicaments ou à des polymorphismes naturels (variabilité inter-souche) pour déterminer si la résistance clinique à l’infection par le VZV est due à la résistance virale aux médicaments

Interprétation des résultats génotypiques du VZV 

Les résultats des tests échouent à détecter les mutations présentes dans 20-30% de la population virale.
Comme des artefacts génotypiques peuvent se produire, en particulier dans les populations mixtes de mutants provenant d’échantillons avec une faible charge virale, il est conseillé de retester dans un nouvel échantillon.
Certaines variantes des gènes de la thymidine kinase et de l’ADN polymérase n’ont pas encore été caractérisées phénotypiquement, et l’impact de ces nouvelles modifications peut être difficile à prédire. La combinaison des tests génotypiques et phénotypiques est nécessaire pour diagnostiquer si les nouvelles modifications des gènes viraux sont associées à la résistance aux médicaments ou à un polymorphisme naturel.

Limites des tests génotypiques pour la résistance aux médicaments du VZV

• Test results fail to detect mutations that are present in 20-30% of the viral population.
• Because genotypic artifacts may occur, in particular in mixed mutant populations from specimens with low viral load, retesting in a new sample is advised.
• Some variants in the thymidine kinase and DNA polymerase genes have not yet been phenotypically characterized and the impact of these novel changes can difficult to predicted. The combination of genotypic and phenotypic testing is necessary to diagnose  whether the novel changes in the viral genes are associated with drug-resistance or with a natural polymorphism.

Détails du test – Phénotypage du VZV

1. Croissance de l’échantillon viral dans des fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains (HEL) jusqu’à ce que 100% de l’effet cytopathique (CPE) soit atteint.
2. Préparation du stock viral à partir des cellules infectées.
3. Test antiviral effectué dans des cellules HEL en utilisant au moins deux inoculums viraux différents et la souche de référence du VZV OKA.
4. Détermination de l’EC50 (concentration efficace à 50%) ou de la concentration de médicament nécessaire pour inhiber l’effet cytopathique viral de 50% pour chaque médicament antiviral.
5. Comparaison des valeurs d’EC50 entre la souche de référence et les échantillons du patient, et détermination de la résistance (rapport EC50 échantillon patient / EC50 souche de référence).

Interprétation des résultats phénotypiques du VZV

Les résultats comprennent les valeurs d’EC50 et la résistance par facteur pour différentes classes de médicaments anti-HSV, inhibiteurs de l’ADN polymérase, y compris les analogues de nucléosides (acyclovir, penciclovir, ganciclovir, brivudine, trifluridine), les analogues de nucléotides (cidofovir et adefovir) et les analogues de pyrophosphate (foscarnet).

Limites des tests phénotypiques pour la résistance aux médicaments du VZV

Les tests phénotypiques ne peuvent pas être effectués pour les échantillons de LCR, de liquide oculaire ou d’écouvillons électroniques en raison de l’échec de la culture du virus à partir de ces types d’échantillons.
Pour une isolation virale réussie, l’échantillon doit être collecté immédiatement dans un milieu de transport viral, stocké réfrigéré à 2-8°C et transporté réfrigéré dans les 48 heures suivant la collecte de l’échantillon.
L’isolement viral est très difficile pour le VZV car le virus reste associé aux cellules et, par conséquent, l’échantillon doit contenir des cellules infectées viables par le VZV.

Instructions pour les échantillons et le transport

https://rega.kuleuven.be/regavir/shipping

Demandes inacceptables

• Échantillon insuffisant
• Mauvais transport ou stockage de l’échantillon
• Formulaire de demande de test ne spécifiant pas le virus pour lequel la résistance aux médicaments doit être étudiée

Temps de réponse (et fréquence des analyses)

Fréquence des analyses: chaque jour ouvrable, pendant les heures de travail
Temps de réponse: 3-5 jours ouvrables pour les tests génotypiques
                                10-20 jours ouvrables pour les tests phénotypiques

Rapport des résultats du test

Les résultats seront envoyés par e-mail selon les souhaits du laboratoire ou du médecin demandeur.