Doel van de test
Klinisch gebruik
Detectie van antivirale resistentie bij patiënten met Varicella-zoster-virus (VZV)-infecties.
Klinische achtergrond
Het Varicella-zoster-virus (VZV) is een alomtegenwoordig humaan herpesvirus, behorend tot de subfamilie van alfa-herpesvirussen, dat wereldwijd populaties beïnvloedt. VZV wordt vaak tijdens de kindertijd opgelopen en veroorzaakt een primaire infectie, varicella of waterpokken. Na de initiële infectie vestigt het virus levenslange latentie in sensorische ganglia, met een risico op daaropvolgende reactivering die resulteert in de ontwikkeling van herpes zoster (HZ) of gordelroos, een pijnlijke huiduitslag, ook wel shingles genoemd. De incidentie en ernst van HZ zijn hoger bij een verzwakte specifieke celgemedieerde immuniteit, voornamelijk als gevolg van gevorderde leeftijd, maligniteit, hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) of transplantatie van solide organen (SOT), immunodeficiëntie of immunosuppressieve medicatietherapie. Vooral HZ blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit bij patiënten die een harttransplantatie ondergaan, vergeleken met andere SOT-ontvangers met lever-, nier- of longtransplantatie. Deze patiënten hebben een verhoogd risico op primaire infectie, reactivering, virale verspreiding met viscerale betrokkenheid, bijkomende bacteriële superinfectie en frequente recidieven. VZV-infecties kunnen ook invaliderende neuralgie veroorzaken bij ernstig immuungecompromitteerde patiënten.
Geneesmiddelen die momenteel zijn goedgekeurd voor het voorkomen of behandelen van VZV-gerelateerde ziekten richten zich op de virale DNA-polymerase. Acyclovir en zijn prodrug valacyclovir worden beschouwd als eerstelijnstherapie, terwijl het gebruik van foscarnet of cidofovir beperkt is tot de therapie van acyclovir- en/of foscarnet-resistente infecties. Het werkingsmechanisme en het resistentiemodel voor geneesmiddelen die VZV-infecties behandelen, is vergelijkbaar met die van geneesmiddelen die HSV-infecties behandelen. Nucleoside-analogen worden eerst gefosforyleerd door de VZV-thymidinekinase [open reading frame 36 (ORF36)], gevolgd door activatie door cellulaire kinasen om de actieve triphosfaatvormen te produceren die de virale DNA-polymerase (ORF28) blokkeren. De helicase-primase-inhibitor amenamevir is goedgekeurd voor de behandeling van gordelroos alleen in Japan. Vanwege de effectiviteit tegen acyclovir-resistente VZV- en HSV-isolaten kan amenamevir als haalbaar alternatief worden gebruikt voor patiënten die falen op eerstelijnsbehandeling. Het medicijn is alleen beschikbaar voor mededogen-ondersteunde behandeling als alternatieve therapie bij hardnekkige / resistente HSV- of VZV-infecties.
Criteria voor het uitvoeren van deze test in de context van referentieactiviteiten
Acyclovir-resistentie bij VZV-infecties is gerapporteerd bij immuungecompromitteerde, maar niet bij immuuncompetente personen. Bij patiënten die een therapeutisch falen vertonen binnen 7 tot 10 dagen na antivirale therapie, moet het VZV-genotyperen worden geëvalueerd en moeten alternatieve geneesmiddelen zoals foscarnet en cidofovir, beide DNA-polymerase-inhibitoren die onafhankelijk van de virale thymidinekinase werken, worden aanbevolen.
Klinisch refractaire en/of resistente VZV-infecties die het oog of het centrale zenuwstelsel aantasten, moeten zowel bij immuuncompetente als immuungecompromitteerde patiënten worden genetyped. Oogmonsters en cerebrospinaal vocht (CSF) moeten snel worden getest om mutaties, deleties en/of substituties in specifieke codons van het VZV-genoom te detecteren om de opkomst van acyclovir-resistentie te evalueren en antivirale therapie aan te passen op basis van het VZV-genotyperen.
VZV-resistentietesten zijn voornamelijk gebaseerd op sequentieanalyse van de virale thymidinekinase (ORF36) en DNA-polymerase (ORF28) genen, aangezien de viruscultuur zelden succesvol is omdat het virus buiten de cellen instabiel is. Omdat compartmentalisatie van virale VZV-mutanten vaak voorkomt, moeten monsters van verschillende lichaamslocaties (zoals diverse huidsafwijkingen, CSF, broncho-alveolaire lavage, oog) longitudinaal worden onderzocht op opkomst van geneesmiddelresistentie om ook de virale dynamiek te evalueren.
Test details – VZV genotypering
Bevat:
- Acyclovir-resistentie: mutaties in de VZV ORF36 thymidinekinase en ORF28 DNA-polymerase genen.
- Cidofovir-resistentie: mutaties in de VZV ORF28 DNA-polymerase genen.
- Foscarnet-resistentie: mutaties in de VZV ORF28 DNA-polymerase genen.
Test omschrijving – VZV genotypering
1. Isolatie van DNA uit het monster.
2. Amplificatie van de VZV-genen die betrokken zijn bij geneesmiddelresistentie door PCR volgens de therapie die aan de patiënt is gegeven
|
VZV gene |
VZV encoded protein |
Function / drug target |
Codons sequenced (partial or complete gene sequence) |
Drug(s) for which resistance is predicted |
|
ORF36 |
Thymidine kinase |
Involved in activation of acyclovir, penciclovir, ganciclovir, and brivudin |
341 (complete sequence) |
(Val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin |
|
ORF28 |
DNA polymerase |
Target of acyclovir, penciclovir, ganciclovir, brivudin, foscarnet, cidofovir |
425-1000 (partial sequence) |
(val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin, foscarnet, cidofovir |
3. Directe sequencing van de amplicons door Sanger dideoxy sequencing, met een detectiegrens van virale mutante subpopulaties van 20%-30%.
4. Sequentie-alignment (de afgeleide sequenties van het patiëntmonster worden vergeleken met de referentie-VZV-stam OKA sequenties).
5. Gedetecteerde mutaties worden vergeleken met een database van bekende mutaties die geassocieerd zijn met geneesmiddelresistentie of natuurlijk voorkomende polymorfismen (inter-stamvariabiliteit) om te bepalen of de klinische resistentie van VZV-infectie te wijten is aan virale geneesmiddelresistentie.
Interpretatie van de VZV-genotypische resultaten
De resultaten omvatten een lijst van de gedetecteerde mutaties en hun associatie met resistentie tegen elk gespecificeerd geneesmiddel, inter-stamvariabiliteit of onvoorspelbare betekenis (nieuwe veranderingen). Afhankelijk van het VZV-genotype worden alternatieve therapeutische opties voorgesteld.
Een resultaat van niet-beschikbaar of onvolledig genotyperen geeft aan dat niet alle virale amplicons konden worden geamplificeerd en sequenties konden worden verkregen. Dit kan te wijten zijn aan onvoldoende virale lading, kwaliteit van het monster (opslag- en transportomstandigheden, leeftijd van het monster), en/of de aanwezigheid van polymerasekettingreactie-inhibitoren.
Beperkingen van genotypische tests voor VZV-geneesmiddelresistentie
Testresultaten missen mutaties die aanwezig zijn in 20-30% van de virale populatie.
Omdat genotypische artefacten kunnen optreden, vooral in gemengde mutante populaties van monsters met een lage virale lading, wordt retesten in een nieuw monster aanbevolen.
Sommige varianten in de thymidinekinase- en DNA-polymerase-genen zijn nog niet fenotypisch gekarakteriseerd en de impact van deze nieuwe veranderingen kan moeilijk te voorspellen zijn. De combinatie van genotypische en fenotypische tests is noodzakelijk om te diagnosticeren of de nieuwe veranderingen in de virale genen verband houden met geneesmiddelresistentie of met een natuurlijk polymorfisme.
Testdetails – VZV-fenotypering
- Groei van het viraal monster in menselijke embryonale long (HEL) fibroblasten tot 100% cytopathisch effect (CPE) is bereikt.
- Bereiding van de virale voorraad met geïnfecteerde cellen.
- Antivirale test uitgevoerd in HEL-cellen met ten minste twee verschillende virale inoculums en de VZV-referentiestam OKA.
- Bepaling van de EC50 (50% effectieve concentratie) of de geneesmiddelconcentratie die nodig is om 50% van het virale CPE te inhiberen voor elk antiviraal geneesmiddel.
- Vergelijking van EC50-waarden tussen de referentiestam en patiëntmonsters en bepaling van de resistentie (ratio EC50 patiëntmonster / EC50 referentiestam).
Interpretatie van de VZV-fenotypische resultaten
De resultaten bevatten EC50-waarden en resistentiefactoren voor verschillende klassen van anti-HSV-geneesmiddelen, DNA-polymerase-inhibitoren, waaronder nucleoside-analogen (acyclovir, penciclovir, ganciclovir, brivudine, trifluridine), nucleotide-analogen (cidofovir en adefovir) en pyrofosfaat-analogen (foscarnet).
Beperkingen van fenotypische tests voor VZV-geneesmiddelresistentie
- Fenotypische tests kunnen niet worden uitgevoerd voor LCR-, oogvocht- of e-swabmonsters vanwege het falen van virale groei uit deze monster types.
- Voor succesvolle virale isolatie moet het monster onmiddellijk worden verzameld in een virustransportmedium, gekoeld worden bewaard bij 2-8°C en gekoeld binnen 48 uur na monsterverzameling worden getransporteerd.
- Virale isolatie is zeer moeilijk voor VZV omdat het virus celgebonden blijft en daarom moet het monster levensvatbare VZV-geïnfecteerde cellen bevatten.
Instructies voor monsters en transport
https://rega.kuleuven.be/regavir/shipping
Onaanvaardbare verzoeken
- Onvoldoende monster
- Verkeerd transport of opslag van het monster
- Testaanvraagformulier dat niet het virus specificeert waarvoor geneesmiddelresistentie moet worden onderzocht
Doorlooptijd (en frequentie van analyses)
Frequentie van analyses: elke werkdag, tijdens werkuren
Doorlooptijd: 3-5 werkdagen voor genotypische tests
10-20 werkdagen voor fenotypische tests
Rapportage van testresultaten
Resultaten worden via e-mail verzonden volgens de wensen van het verzoekende laboratorium of arts.