En bref
Ces dernières années, de nombreux laboratoires cliniques ont adopté la spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour identifier des espèces bactériennes dans des échantillons cliniques. Cette puissante technique permet de comparer rapidement l’empreinte protéique unique d’une bactérie à une grande base de données, et donc d’identifier des espèces de manière fiable. Son application en mycobactériologie a toujours été compliquée, notamment en raison des parois cellulaires robustes de ces bactéries. C’est la raison pour laquelle le Centre national de Référence (CNR) pour la mycobactériologie, en collaboration avec des experts en spectrométrie de masse, a cherché à optimiser la préparation des échantillons. Par ailleurs, nous étudions la possibilité d’utiliser cette même technique pour déterminer la sensibilité de mycobactéries à certains antibiotiques. Le protocole obtenu est mis librement à la disposition des laboratoires cliniques qui peuvent l’intégrer à leur flux de travaux. Actuellement, l’efficacité de cette technique fait l’objet d’une étude dans le cadre d’un consortium européen de laboratoires mycobactériens cliniques.
Description du projet
Le genre Mycobacterium englobe au moins 175 espèces identifiées affichant un large spectre de pathogénicité. M. tuberculosis (MTB), principale cause de la tuberculose (TB), représente l’une des plus grandes menaces pour la santé publique dans les pays à faible revenu. Selon le dernier rapport de l’OMS, la TB constitue, conjointement avec le VIH, l’une des causes principales de mortalité dans le monde, avec près de 9,6 millions de nouveaux cas recensés en 2014 et 1,5 million de décès. La MTB est un pathogène obligatoire. Cependant, les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont des organismes naturels qui se comportent parfois comme des pathogènes opportunistes, à l’origine d’une multitude de syndromes cliniques. Le nombre de cas d’infections par MNT recensés a augmenté de façon significative au cours ces dix dernières années ; une augmentation liée au nombre croissant de patients immunodéprimés, à l’utilisation d’outils diagnostiques avancés et à une meilleure connaissance du rôle des MNT dans le développement de maladies. Pourtant, seules 29 des 160 espèces de MNT reconnues sont associées à une maladie humaine ; d’autres espèces (M. gordonae, par exemple) sont des contaminants que l’on retrouve fréquemment dans les échantillons prélevés ou traités. Par conséquent, les laboratoires de diagnostic doivent procéder à une identification des espèces, afin de déterminer la signification clinique d’un isolat mycobactérien dans des échantillons cliniques. Traditionnellement, l’identification d’espèces mycobactériennes s’appuie principalement sur la caractérisation des traits phénotypiques et biochimiques. Des méthodes plus récentes consistent en une analyse chromatographique de profils d’acides mycoliques, ou en l’utilisation de sondes d’ADN qui ciblent des espèces courantes du genre Mycobacterium. À ce jour, le séquençage ADN des gènes16S ARNr, rpoB et/ou hsp65 reste l’approche de référence en matière d’identification des espèces. Néanmoins, ces méthodes relativement coûteuses et fastidieuses nécessitent des compétences et des équipements spécifiques et sont généralement réservées aux laboratoires de référence.
De la même manière, les tests de sensibilité des mycobactéries aux médicaments, basés sur les cultures, demandent beaucoup de temps. La méthode actuelle de référence pour la MTB est la plateforme MGIT 960/ TBeXiST, laquelle évalue le développement des bactéries en fonction de la consommation d’oxygène. Certes, des techniques moléculaires récentes permettent de détecter rapidement des marqueurs génétiques de résistance dans la MTB, mais elles impliquent également des tests de sensibilité sur culture pour tous les antituberculeux disponibles. En ce qui concerne les souches de MNT, la microdilution en bouillon est reconnue comme méthode recommandée. Cependant, de larges écarts ont été observés entre les résultats de traitements in vivo et les sensibilités in vitro, tandis que les données probantes cliniques associées aux quelques seuils critiques déterminés sont insuffisantes. C’est pourquoi la plupart des laboratoires de diagnostic choisissent soit l’ancienne méthode des proportions sur gélose, soit des plateformes commerciales de microdilution en bouillon afin de déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour différents antimicrobiens. Toutefois, l’interprétation des résultats de ces plateformes pose des problèmes pour les mycobactéries à croissance lente et est sujette à variations d’un laboratoire à un autre. Par ailleurs, une simple valeur de CMI sans seuil critique n’est généralement d’aucune utilité pour les médecins.
Ces dernières années, des progrès majeurs ont été accomplis dans l’application de la spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization−time of flight) pour l’identification des espèces en mycobactériologie Contrairement à la plupart des bactéries, les mycobactéries impliquent l’inactivation et la désintégration préalables de la paroi cellulaire riche en acides mycoliques, pour des raisons de biosécurité et pour permettre la libération des protéines cellulaires.
Dans le cadre de ce projet, nous étudions la possibilité d’utiliser la spectrométrie MALDI-TOF pour l’identification des espèces et la réalisation de tests de sensibilité de mycobactéries aux médicaments.
