Polyomavirus typering en genotypering

Doel van de test

Klinisch gebruik
Detecteren van antivirale resistentie bij patiënten met een BK-polyomavirus (BKPyV) infectie.

Klinische achtergrond
Menselijke polyomavirussen (HPyV) omvatten een groep van 14 soorten die doorgaans asymptomatische infecties veroorzaken bij gezonde personen en in latente, asymptomatische toestand blijven. Bij immuungecompromitteerde patiënten kunnen HPyV echter ernstige ziekten veroorzaken, zoals kanker (Merkelcel-polyomavirus, MCPyV), nierziekten (BK-polyomavirus, BKPyV) en fatale herseninfecties (JC-polyomavirus, JCPyV).

Een BKPyV-infectie is vooral relevant bij ontvangers van een niertransplantatie of hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT), waarbij het kan leiden tot polyomavirus-geassocieerde nefropathie (PVAN) en uiteindelijk het verlies van de getransplanteerde nier of tot hemorragische cystitis (HC). Aangezien er geen specifieke antivirale behandelingen beschikbaar zijn voor BKPyV, blijft het verminderen van immunosuppressie de belangrijkste aanpak voor de behandeling van PVAN, ondanks het risico op afstoting van het transplantaat.

Cidofovir, een breedspectrum antiviraal middel tegen DNA-virussen, evenals fluoroquinolonen, leflunomide en intraveneuze immunoglobulinen worden overwogen als aanvullende therapie bij PVAN, hoewel hun klinische effectiviteit tegen BKPyV niet volledig is vastgesteld. Niet alle patiënten reageren even goed op een behandeling met cidofovir; sommigen blijven tekenen van BKPyV-infectie vertonen na de therapie. Vergelijkbare farmacologische benaderingen worden toegepast bij de behandeling van HC, hoewel het verminderen van immunosuppressie bij HSCT-patiënten het risico op acute afstoting verhoogt en de graft-versus-hostziekte (GvHD) kan verergeren.

Criteria voor het uitvoeren van deze test in het kader van referentieactiviteiten

In vitro-onderzoeken hebben aangetoond dat cidofovir-resistentie bij het niet-menselijke primatenpolyomavirus SV40 verband houdt met veranderingen in het virale Large T-antigeen (LTag). Daarom wordt aangenomen dat therapiefalen met cidofovir bij patiënten die worden behandeld voor BKPyV-ziekte ook geassocieerd kan zijn met mutaties in het BKPyV-genoom. Patiënten die niet reageren op cidofovir bij BKPyV-ziekte moeten worden gemonitord op het ontstaan van geneesmiddelresistentie.

Testdetails – PyV-detectie en -typering / BKPyV-genotypering

Omvat:

1. Detectie van JCPyV en BKPyV.
2. Typing van BKPyV.
3. Cidofovir-resistentie: mutaties in het LTag-gen.

Beschrijving van de test – PyV-detectie en -typering / BKPyV-genotypering

1. Isolatie van DNA uit het monster.
2. Amplificatie van het volledige genoom voor JCPyV en BKPyV.
3. Directe sequencing van het VP1-gen via Sanger dideoxy sequencing, met een detectielimiet van 20-30% voor virale mutantpopulaties.
4. Sequentie-uitlijning: de verkregen sequenties van het patiëntmonster worden uitgelijnd met de referentiesequentie van de Dunlop-stam van BKPyV.
5. Typing van BKPyV gebeurt volgens het artikel van Morel et al., 2017 (PMID: 28151406).
6. Vergelijking van de VP1-sequentie van de patiënt met andere BKPyV-stammen binnen dezelfde subgroep om de meest overeenkomstige VP1-sequentie te identificeren.
7. Directe sequencing van het LTag-gen via Sanger dideoxy sequencing, met een detectielimiet van 20-30% voor virale mutantpopulaties.
8. Analyse van LTag-mutaties: de LTag-sequenties van nauw verwante monsters worden gebruikt als referentie om mogelijke mutaties die verband houden met cidofovir-resistentie te identificeren.

Interpretatie van de resultaten – BKPyV-typering / genotypering

• De resultaten bevatten een lijst met gedetecteerde mutaties in het VP1-gen (volledige sequentie, 362 aminozuren) die het mogelijk maakt om het BKPyV-type te bepalen.
• De resultaten bevatten ook een lijst met mutaties in het LTag-gen (volledige sequentie, 695 aminozuren) die mogelijk verband houden met cidofovir-resistentie.

Een resultaat van onvolledige of niet-beschikbare genotypering betekent dat niet alle virale amplicons konden worden geamplificeerd en gesequenced. Mogelijke oorzaken zijn: Onvoldoende virale lading, Kwaliteit van het monster (opslag- en  transportomstandigheden, „ouderdom” van het monster). Aanwezigheid van polymerasekettingreactie (PCR)-remmers

Limitaties van de genotyperingstests voor BKPyV-geneesmiddelresistentie

• De test detecteert geen mutaties die aanwezig zijn in 20%-30% van de virale populatie.
• De test is het meest betrouwbaar als de virale lading in het monster minimaal 3 log10 IU/ml (1.000 IU/ml) bedraagt. Resultaten bij lagere virale ladingen moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en bevestigd in een nieuw monster.
• Genotypische artefacten kunnen optreden, vooral bij gemengde mutantpopulaties in monsters met een lage virale lading. Hertoetsing met een nieuw monster wordt aanbevolen.

Instructies voor monsters en transport

https://rega.kuleuven.be/regavir/shipping

Onaanvaardbare aanvragen

• Ongeschikt of onvoldoende monster.
• Onjuist transport of onjuiste opslag van het monster.
• Niet volledig ingevuld aanvraagformulier, zonder vermelding van het virus waarvoor geneesmiddelresistentie moet worden onderzocht.

Doorlooptijd (en frequentie van de analyse)

Frequentie van de analyse: elke werkdag tijdens kantooruren.

Responstijd: 3 tot 7 werkdagen.

Rapportage van testresultaten

De resultaten worden per e-mail verzonden volgens de voorkeuren van het aangevraagde laboratorium of de behandelend arts.